Ông sinh ra ở vùng Dole nhưng bắt đầu đi học tại Arbois. Từ nhỏ ông không học giỏi tài năng duy nhất của ông là vẽ, Louis Pasteur muốn vào học Trường Sư phạm Paris (École normale supérieure). Để thực hiện mong muốn này, vào tháng 10 năm 1838 ông chuyển đến Paris. Tuy nhiên vì thất vọng với cuộc sống mới ở đây, ông bỏ luôn ý định vào học Trường Sư phạm và rời Paris để đến học tại Trường Trung học Hoàng gia tại Besançon. Vào năm 1840 rồi năm 1842, ông thi lấy bằng Tú tài Văn chương và Tú tài Toán. Với những kết quả học tập đáng kích lệ này, một lần nữa Louis Pasteur lại chuyển đến Paris và cuối cùng vào năm 1843 ông được xếp hạng tư trong kỳ thi vào Trường Sư phạm Paris và được nhận vào học ở ngôi trường danh tiếng này. Tại đây Louis Pasteur theo học hóa học và vật lý và cả tinh thể học (cristallographie). Vào các buổi chiều chủ nhật, Louis Pasteur thường làm việc tại phòng thí nghiệm của nhà hóa học nổi tiếng Jean-Baptiste Dumas nhờ đó mà ông đã tích lũy được những kiến thức và kỹ năng quý báu cho công việc nghiên cứu độc lập trong tương lai. Sau khi làm việc với vai trò giáo sư hóa học một thời gian ngắn tại Đại học Strasbourg, ở đây ông gặp và quen Marie Laurent, cô là cháu của hiệu trưởng nhà trường năm 1849. Họ cưới nhau ngày 29 tháng 5 năm 1849, và có năm con, chỉ 2 trong số con của họ còn sống, 3 người con còn lại chết vì thương hàn. Nghịch cảnh trên đã thúc đẩy ông có những phát minh trong việc trị các bệnh truyền nhiễm.[2][6]